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Hai appena eseguito un metodo gradiente che ha funzionato perfettamente la scorsa settimana. Gli standard di calibrazione sembrano puliti, ma il cromatogramma del campione mostra un picco extra a 23,8 minuti. Sostituisci la colonna, prepari un nuovo tampone e controlli il rilevatore. Il picco è ancora lì. Quindi si scambia l'acqua entrando nella fase mobile e l'artefatto scompare. Questa è la realtà della cromatografia liquida ad alte prestazioni: la purezza dell'acqua è alla base di ogni separazione e, quando cambia, anche il metodo cambia con essa.
La purezza dell'acqua influisce sulla qualità dei dati HPLC in quattro modi pratici: stabilità della linea di base, forma dei picchi, riproducibilità della ritenzione e durata dello strumento. I contaminanti coinvolti possono essere molecole organiche, ioni disciolti, particelle o microbi. Anche una piccola quantità di un tipo di impurità può produrre conseguenze sproporzionate rispetto alla sua concentrazione.
I principali effetti della purezza dell'acqua sull'HPLC
In un sistema HPLC, l'acqua è un reagente, non un fondo passivo. Trasporta il tampone, dissolve il campione e contribuisce al fondo del rivelatore. Le impurità presenti nell'acqua si spostano quindi direttamente nel segnale analitico. La tabella seguente riassume i contaminanti più comuni e i loro effetti.
| Contaminant | Esempi o fonte | Effetto in HPLC |
|---|---|---|
| Composti organici disciolti | Sostanze umiche, plastificanti, residui di pulizia, vapori di solventi | Picchi fantasma che assorbono i raggi UV, deriva della linea di base, cambiamenti di ritenzione |
| Ioni inorganici | Sodio, cloruro, silicato, metalli in traccia | Cambiamenti di conduttività, interferenza nella cromatografia ionica e LC-MS, ampliamento dei picchi correlato ai metalli |
| Particolati | Particelle di resina, polvere, precipitati | Frit bloccati, contropressione in aumento, usura delle guarnizioni della pompa, linea di base rumorosa |
| Gas disciolti | Ossigeno, anidride carbonica, azoto | Bolle nel rilevatore, picchi della linea di base, deriva del pH |
| Microrganismi | Batteri e biofilm nei contenitori di conservazione | Incrostazione della colonna, fritte intasate, picchi spuri, instabilità del metodo |
Questi effetti non sono solo teorici. Un biofilm microbico in un serbatoio d’acqua può rilasciare metaboliti che assorbono i raggi UV e, una volta che il film si forma, la semplice sostituzione dell’acqua potrebbe non risolvere il problema finché il serbatoio non viene pulito e igienizzato.
Cosa significano effettivamente "grado HPLC" e acqua di tipo 1
La maggior parte dei metodi analitici richiede acqua che soddisfi le specifiche di Tipo 1. In termini pratici, ciò significa che la resistività a 25 gradi Celsius è di circa 18,2 megaohm-centimetri, la conduttività è vicina a 0,055 microsiemens per centimetro e il carbonio organico totale è sufficientemente basso da impedire all'acqua di creare uno sfondo UV o MS visibile. La sola resistività non è sufficiente. È inoltre necessario conoscere il livello di TOC, il conteggio delle particelle e, in alcune applicazioni, i valori di silicato o sodio.
Il pH dell'acqua purificata non è una specifica utile. L’acqua ultrapura non ha quasi alcuna capacità tampone e assorbe rapidamente l’anidride carbonica dall’aria, quindi un pH misurato intorno a 5,6 riflette semplicemente la CO2 disciolta. Il pH che conta è il pH della fase mobile tamponata che prepari.
I requisiti di qualità dell'acqua dipendono anche dal rilevatore. Il rilevamento UV a 210 nm è particolarmente sensibile alla contaminazione organica perché lì vengono assorbiti molti legami carbonio-ossigeno e carbonio-azoto. LC-MS necessita di acqua con impurità non volatili molto basse per evitare la soppressione ionica e la formazione di addotti. I rilevatori evaporativi sono influenzati in modo simile dalla contaminazione non volatile perché aumenta il segnale di fondo. L'acqua di tipo 1 è quindi un valido punto di partenza per quasi tutte le applicazioni HPLC.
L'acqua in bottiglia di grado HPLC può funzionare, ma deve essere conservata e gestita correttamente. Controlla il certificato di analisi, registra il numero di lotto e non dare mai per scontato che un vecchio contenitore sia privo di crescita biologica.
L'eluizione gradiente rende visibili le impurità dell'acqua
Le impurità dell'acqua sono più visibili nei metodi gradiente. In una corsa isocratica, un contaminante che assorbe i raggi UV può semplicemente alzare leggermente la linea di base. In un gradiente, la frazione dell'acqua inizia in alto e la frazione dei solventi organici aumenta nel tempo. I contaminanti possono essere trattenuti in testa alla colonna e poi eluiti man mano che il contenuto organico aumenta. Ciò produce picchi fantasma e una linea di base alla deriva che possono interferire con l'integrazione e la quantificazione.
Ecco perché un gradiente vuoto è uno dei controlli più semplici per la qualità dell'acqua. Esegui il gradiente esatto senza iniettare un campione. Se compaiono dei picchi nel bianco, la fase mobile è sospetta.
Abitudini quotidiane che proteggono la purezza dell'acqua
L’acqua pura non rimane pura per caso. Le seguenti abitudini prevengono i problemi più comuni nella pratica HPLC.
- Utilizzare l'acqua proveniente da un sistema di purificazione con cartucce nuove, una lampada UV funzionante e una sanificazione regolare.
- Raccogli l'acqua in un contenitore pulito e tappato. Non lasciare il contenitore aperto mentre il sistema è in funzione.
- Non conservare l'acqua per giorni. Preparare la fase mobile con acqua dolce lo stesso giorno, quando possibile.
- Evitare di aggiungere acqua dolce a un serbatoio parzialmente pieno. Sostituire il contenuto del serbatoio invece di rabboccarlo.
- Eseguire un gradiente vuoto alla lunghezza d'onda utilizzata per l'analisi e registrare il risultato.
- Documenta la resistività, il TOC e la data di raccolta dell'acqua nei tuoi registri analitici.
Per i laboratori che utilizzano acqua in bottiglia valgono le stesse regole. Controllare la data di scadenza, chiudere il contenitore immediatamente dopo l'uso e non rimettere l'acqua non utilizzata dal bicchiere alla bottiglia.
Gli additivi trasformano un problema idrico in un problema di metodo
Le fasi mobili raramente contengono solo acqua. Sali tampone, acidi, reagenti per coppie ioniche e alcuni modificatori specializzati vengono aggiunti a concentrazioni relativamente basse. Se l'acqua contiene tracce di impurità che assorbono i raggi UV, tali impurità potrebbero non modificare la capacità del tampone, ma possono comunque apparire nel segnale del rilevatore.
I liquidi ionici vengono talvolta utilizzati come modificatori della fase mobile per migliorare la forma o la selettività dei picchi. Quando ne scegli uno, dovrebbe applicarsi lo stesso standard di purezza. Ad esempio, Tetrafluoroborato di 1-etil-3-metilimidazolio è un liquido ionico comune per studi cromatografici. Dovrebbe essere sciolto in acqua che già soddisfa le specifiche di Tipo 1; in caso contrario, l'additivo diventa un'altra fonte di contaminazione. Se vuoi comprendere le proprietà legate alla separazione di questi composti, ns panoramica del comportamento dei liquidi ionici nei processi di separazione copre le variabili pratiche.
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A Zhejiang Ldet produciamo liquidi ionici e prodotti chimici speciali. Sappiamo dalla produzione che una traccia di impurità in un materiale di partenza può modificare le prestazioni a valle. Ecco perché controlliamo il contenuto di acqua, gli alogenuri residui e il comportamento ai raggi UV prima del rilascio. La stessa disciplina vale in un laboratorio HPLC: scegliere materiali dotati di specifiche documentate. Ad esempio, Tetrafluoroborato di 1-butil-3-metilimidazolio è disponibile con dati di purezza che ti consentono di valutare se è compatibile con il tuo metodo di rilevamento.
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- Contenuto residuo di alogenuri, poiché gli alogenuri possono influenzare le separazioni a scambio ionico e la corrosione.
- Contenuto d'acqua, perché l'acqua modifica la concentrazione effettiva dell'additivo.
- Uno spettro UV o un taglio UV, in modo da poter prevedere l'assorbanza dello sfondo.
- Coerenza da lotto a lotto, perché un nuovo lotto non dovrebbe modificare silenziosamente il tuo metodo.
Se hai bisogno di aiuto per abbinare un materiale a un metodo, puoi farlo discutere i dati sulla purezza e i requisiti personalizzati con il nostro team tecnico .
Trattare l'acqua come parte del metodo
La purezza dell'acqua nell'HPLC non è una configurazione una tantum. È una variabile quotidiana che può cambiare con la stagione, la bottiglia di stoccaggio e lo stato del sistema di depurazione. Utilizzare acqua di tipo 1, verificare il TOC e la resistività, gestirla correttamente e scegliere additivi tracciabili. In un metodo basato su nanogrammi di analita, l'acqua non è mai "solo acqua".
